Versuch zur Visualisierung der Vermehrung einzelner Hefezellen verschiedener Arten.

1. Idee:

Hefezellen sollen zur vegetativen Vermehrung angeregt werden. Dieser Vorgang der Zellteilung wird Sprossung genannt und soll hier als Film dargestellt werden.

2. Aufbau und Durchführung:

Die Herstellung des Nährmediums:

Erster Teil des Nährmediums:
Es wird eine wässrige Lösung mit folgenden Inhaltsstoffen bereitet:

Glucose 8% (80 g/l)

Hefeextrakt 1% (10 g/l)

Pepton 2% (20 g/l)

Diese Lösung wird gut gerührt und mit Hilfe eines pH-Meters und einer Natronlauge auf pH 6,7 bis pH 7,0 eingestellt.
Anschließend werden mit einer Pipette jeweils 5 ml in insgesamt 20 Reagenzgläser (10 ml) mit Schraubverschluß gegeben. Zu diesen Reagenzgläsern kommt eine Konzentrationen von 0,8 % Agar hinzu.
Die Reagenzgläser werden verschlossen, gut geschüttelt und bei 121°C, 20 Minuten autoklaviert.
Bis zum Gebrauch werden die Reagenzgläser bei Zimmertemperatur gelagert.

Zweiter Teil des Nährmediums.
Dieser Teil wird getrennt hergestellt und konserviert, um das darin enthaltene Ergosterin nicht zu zerstören. Mit einer Pipette werden ca. 14 ml Ethanol in einen Kolben (20 ml) gefüllt und mit Hilfe eines Wasserbades aufgewärmt. 100 mg Ergosterin werden mit einer Waage gewogen und hinzugefügt. Mit einer Pipette werden 5 ml Tween 80 hinzugefügt. Da diese Stoffe sich sehr schlecht lösen, muß sehr lange gewärmt und geschüttelt werden. Aufbewahrt wird dieser Kolben im Kühlschrank bei 5°C.
Das Zusammenfügen der Medien vor dem Mikroskopieren.
Die Ergosterin Lösung wird vor der Zugabe wieder aufgewärmt um die ausgefallene Stoffe wieder in Lösung zu bringen.
Um die gelierten Inhalte der Reagenzgläser zu verflüssigen, werden diese ebenfalls aufgewärmt.
Mit einer Eppendorfpipette werden 10 ul Ergosterinlösung entnommen und eines der ausgewählten Reagenzgläser hinzugefügt und gut geschüttelt.

Die Präparation der Hefen auf dem Objektträger.
Ist das Nährmedium wieder erhärtet muß es nochmals vor der Entnahme wieder erwärmt und dadurch verflüssigt werden. Mit einer Eppendorf Pipette wird ca. 30 ul Nährmedium aus einem Reagenzglas auf ein Objektträger aufgebracht. Mit einer sterilen Impföse wird ein Tropfen aus einem durchgeschüttelten Gäransatz entnommen und mit dem Nährmedium vermischt. Dieses Medium wird mit einem Deckglas abgedeckt. Um eine möglichst geringe Schichtdicke zu erreichen wird mit Hilfe der Seite eines zweiten Objektträgers das Deckglas fest auf der Objektträger aufgedrückt. Überschüssiges Medium, welches auf der Seite austritt wird mit einem Papiertuch entfernt. Um anschließend eine Verdunstung und das daraus erfolgende Austrocknen des Mediums unter dem Deckglas zu verhindern, wird der Rand mit Glycerin abgedichtet.

Die Einstellung des Mikroskops.
Der Objektträger wird nun auf den Objekttisch eingespannt. Die Lampe unter dem Mikroskop wird eingeschaltet und die Blende weit geöffnet. Mit Hilfe des kleinen Okulars sucht man nun einzeln stehende Hefezellen. Diese wird nach erfolgter Schärfeeinstellung mit dem nächst größeren Okular genau focussiert, bis das größte Okular diese Hefezelle scharf im Visier hat. Als zusätzliche Verstärkung der Auflösung wird noch ein Tropfen Immersionsöl zwischen dem Okular und dem Deckglas zugefügt.

Die Aufzeichnungen der Zellteilungen.
Eine auf dem Mikroskop sitzende Kamera liefert die Bilder an einen Videorecorder. Dieser nimmt nun die Zellteilung auf.

Die Digitalisierung in den Computer.
Über eine Video Karte werden ca. 1 mal pro Minute ein Bild aufgezeichnet. Diese Bilder werden in einer Animation zusammengefaßt.

3. Ergebnis:

Folgende Filme der Vegetativen Vermehrung wurden hergestellt.

Vegetative Vermehrung von Saccharomyces cerevisiae

Vegetative Vermehrung von Kloeckera apiculata

Vegetative Vermehrung von Shizosaccharomyces pompe

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